Trattare il Cancro con il Plasma Freddo? L’ingegnere Aerospaziale della Purdue Alexey Shashurin Contribuisce alla Prima Sperimentazione Clinica

Abbiamo voluto dividere la relazione in due parti, la prima accessibile a tutti con le indicazioni generiche del caso e la seconda estremamente tecnica affinché gli addetti ai lavori possano conoscere dettagli terapeutici estremamente approfonditi che possano stimolare la loro apertura mentale e la visione d’insieme di un mondo che sorprende noi della redazione ogni giorno di più.

Vogliamo sottolineare come gran parte della ricerca sul cancro prima di prendere una direzione terapeutica in campo medico, abbia una indirizzo militare legato tra l’altro ai servizi segreti, dove gli investimenti sono ingenti per non dire praticamente illimitati, per poi finire dove lo sviluppo di qualsiasi terapia non può che avere un seguito sempre parziale visti gli interessi non commerciali e non affini alle logiche politiche neoliberiste ormai consolidate in ogni ambito sociale.

Abbiamo migliaia di ricerche sviluppate da giovani ricercatori e non abbiamo la possibilità di esporle tutte al nostro pubblico per motivi infrastrutturali ed economici, ma cercheremo in tutti i modi di rendere accessibili a ciascuno di voi le cose che riteniamo importanti sapere, considerando il fatto che già oggi una persona su 3 avrà a che fare con questa patologia tutt’altro che incurabile dove lo scoglio non è la scienza e nemmeno il denaro, ma chi la gestisce e che l’unica soluzione possibile è prenderne coscienza e tenere tra le mani le redini di una società in balia di criminali istituzionali, politici economici e sociali. ….il Covid Insegna!

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Trattare il Cancro con il Plasma Freddo

L’ingegnere aerospaziale della Purdue Alexey Shashurin ha contribuito allo sviluppo del sistema al plasma freddo e del bisturi Canady Helios, approvato dalla FDA per l’uso in studi clinici.

WEST LAFAYETTE, Ind. – La tecnologia del plasma atmosferico freddo, attualmente l’unico modo per rimuovere i microscopici tumori cancerosi rimasti dopo l’intervento chirurgico, è stata approvata dalla Food and Drug Administration statunitense per la prima volta in uno studio clinico.

Per i tumori solidi, come quelli del seno e dei polmoni, il trattamento standard prevede la chemioterapia, le radiazioni, l’intervento chirurgico o tutti gli altri. Quando questi tumori non vengono completamente rimossi, possono causare la ricomparsa del cancro. Circa il 20%-40% delle donne sottoposte ogni anno a mastectomia parziale negli Stati Uniti, ad esempio, torna in sala operatoria a causa di tumori marginali che il chirurgo non è riuscito a vedere la prima volta.

Un team composto da più istituti, tra cui l’ingegnere aerospaziale Alexey Shashurin della Purdue University, ha sviluppato un elettrobisturi simile a una penna che spruzza un getto blu di plasma freddo su qualsiasi tessuto o cellula cancerosa residua per 2-7 minuti. Il dispositivo colpisce solo i tumori, lasciando illeso il tessuto circostante, come dimostrato in vitro, in vivo e in casi di uso compassionevole approvati dalla FDA prima della sperimentazione clinica.

U.S. Medical Innovations LLC (USMI) e il Jerome Canady Research Institute for Advanced Biological and Technological Sciences (JCRI/ABTS) hanno guidato il team e sponsorizzano la sperimentazione clinica, che prevede il reclutamento dei pazienti a settembre.

Nel 2014 USMI ha sviluppato e brevettato il primo generatore elettrochirurgico ad alta frequenza con plasma freddo per il trattamento selettivo del cancro.

La tecnologia, approvata per uno studio clinico di fase I della FDA su 20 pazienti, è stata sviluppata da un team guidato da Canady, chief science officer di JCRI/ABTS, CEO di USMI e professore di ricerca presso la School of Engineering and Applied Sciences della George Washington University; un team di ingegneri guidato da Taisen Zhuang, vicepresidente della ricerca e dello sviluppo dell’USMI; Michael Keidar, professore della School of Engineering and Applied Sciences e direttore del laboratorio Micropropulsion and Nanotechnology della George Washington University; e Shashurin, professore assistente della School of Aeronautics and Astronautics della Purdue.

“I plasmi sono molto reattivi e possono causare una serie di risposte a livello cellulare nei tessuti biologici. Ma poiché sono anche gas estremamente caldi, negli ultimi 20 anni si è cercato di generare e testare plasmi freddi per applicazioni biologiche”, ha detto Shashurin.

Oltre a sviluppare soluzioni al plasma freddo per la tecnologia di trattamento del cancro, il laboratorio di Shashurin conduce anche ricerche su vari argomenti delle scienze sperimentali del plasma. Tra questi, la generazione e la diagnostica di plasmi freddi in miniatura a pressione atmosferica, l’applicazione del plasma freddo per la sterilizzazione, il plasma indotto dal laser per la diagnostica della combustione, la propulsione avanzata dei veicoli spaziali e le scariche di plasma ripetitive al nanosecondo per il controllo del flusso aerodinamico.

Nel 2008, Keidar e Shashurin sono stati tra i primi ricercatori a sviluppare un generatore di plasma freddo e a vedere che produceva risposte dai tessuti biologici. Nel 2011, il team ha pubblicato un articolo sul British Journal of Cancer che dimostra che il plasma freddo uccide selettivamente le cellule tumorali in modelli animali.

Nel 2013 Keidar e Shashurin hanno iniziato a collaborare con l’USMI per creare un prototipo su scala industriale del generatore di plasma freddo e la sua applicazione per il trattamento del cancro, sulla base di un generatore che avevano sviluppato e brevettato. L’obiettivo era quello di integrare il plasma freddo con gli elettrobisturi Canady Hybrid Plasma già utilizzati nelle sale operatorie, perché questi bisturi consentono di effettuare interventi chirurgici senza sangue. Ciò è dovuto alla loro capacità di tagliare e coagulare i tessuti allo stesso tempo, sigillando i vasi sanguigni.

Questa tecnologia al plasma freddo uccide selettivamente i tumori attraverso molecole tossiche chiamate specie reattive dell’ossigeno, che danneggiano il tessuto canceroso mirato ma non il tessuto biologico normale. Anche i laser potrebbero uccidere i tessuti, ma il calore elevato provocherebbe danni permanenti ai tessuti circostanti.

Per colmare i vantaggi degli elettrobisturi e del plasma freddo, il JCRI/ABTS e l’USMI hanno convertito i generatori elettrochirurgici standard ad alta frequenza in generatori di plasma freddo.

“L’applicazione del plasma freddo è il quarto braccio per il trattamento del cancro, dopo la chemioterapia, le radiazioni e la chirurgia. Non esiste un’altra ‘pallottola magica’ per eliminare il tessuto residuo“, ha detto Canady.

Uno dei siti di sperimentazione clinica per questo dispositivo sarà la Rush University di Chicago. Nel frattempo, il laboratorio di Shashurin alla Purdue continuerà a collaborare con l’USMI per l’ulteriore sviluppo di questa tecnologia.

Il lavoro si allinea con la celebrazione del Giant Leaps della Purdue, che riconosce i progressi globali dell’università in materia di salute, longevità e qualità della vita nell’ambito del 150° anniversario della Purdue. Questo è uno dei quattro temi del Festival delle idee, che dura tutto l’anno e che ha lo scopo di presentare Purdue come un centro intellettuale che risolve i problemi del mondo reale.

L’effetto del trattamento con plasma atmosferico freddo sulle cellule staminali del cancro

L’eterogeneità intratumorale sfida i paradigmi esistenti per la terapia antitumorale. L’accumulo di prove dimostra che il modello delle cellule staminali del cancro (CSC) e il modello dell’evoluzione clonale contribuiscono reciprocamente all’eterogeneità intratumorale, poiché le CSC stesse subiscono un’evoluzione clonale. La limitazione delle terapie antitumorali convenzionali può portare al fallimento del trattamento e alla recidiva del cancro, principalmente a causa della resistenza ai farmaci e delle capacità di autorinnovamento delle CSC.

Questi due fattori sono responsabili della resistenza ai trattamenti oncologici standard. In questo studio, esaminiamo il trattamento con plasma atmosferico freddo (CAP) delle CSC in vitro. Abbiamo dimostrato che due tipi di popolazioni eterogenee di CSC derivate da un tumore di un singolo paziente sono sensibili agli effetti del trattamento con plasma. Sorprendentemente, la popolazione di CSC più aggressiva (C13) è risultata più sensibile al trattamento CAP rispetto al tipo meno aggressivo (C12).

Sorgente di plasma atmosferico freddo di dimensioni microscopiche per il trattamento del cancro al cervello e al seno — Zhitong Chen, Li Lin, Qinmin Zheng, Jonathan H.Sherman, Jerome Canady, Barry Trink, Michael Keidar (Sotto)

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Un nuovo dispositivo al plasma atmosferico microfreddo per il glioblastoma in vitro e in vivo

Il trattamento con plasma atmosferico freddo (CAP) è una tecnologia emergente e in rapida espansione per il trattamento del cancro. L’irradiazione diretta con getto CAP è limitata alla pelle e può essere invocata come terapia aggiuntiva durante l’intervento chirurgico, poiché provoca la morte cellulare solo negli strati superiori da tre a cinque cellule. Tuttavia, le attuali cannule da cui fuoriesce il plasma sono troppo grandi per le applicazioni intracraniche.

Per migliorare l’efficienza ed espandere l’applicabilità del metodo CAP per i tumori cerebrali e ridurre la portata del gas e le dimensioni del getto di plasma, è stato sviluppato un nuovo dispositivo CAP di dimensioni micro (µCAP), utilizzato per colpire i tumori del glioblastoma nel cervello murino. Per valutare la fisica della µCAP all’elio sono state applicate diverse tecniche di diagnostica del plasma, come la densità di elettroni, la tensione di scarica e la spettroscopia di emissione ottica (OES). Gli effetti diretti e indiretti del µCAP sulle cellule tumorali di glioblastoma (U87MG-RedFluc) sono stati studiati in vitro. I risultati indicano che il µCAP genera specie e radicali a breve e lunga vita (radicale idrossile (-OH), perossido di idrogeno (H2O2) e nitrito (NO2-), ecc.) con un aumento della morte delle cellule tumorali in modo dose-dipendente. La trasposizione di questi risultati a un contesto in vivo dimostra che la µCAP intracranica è efficace nel prevenire la crescita del tumore del glioblastoma nel cervello del topo.

Il dispositivo µCAP può essere utilizzato in modo sicuro nei topi, con conseguente soppressione della crescita tumorale. Queste osservazioni iniziali stabiliscono che il dispositivo µCAP è uno strumento terapeutico ablativo potenzialmente utile nel trattamento del glioblastoma.

1. Introduzione

Il plasma è un gas ionizzato costituito da cariche positive/negative, radicali, atomi neurali e fotoni ultravioletti (UV), cioè una materia gassosa con cariche quasi neutre [1,2,3]. Il plasma atmosferico a temperatura ambiente o quasi ha portato a un nuovo campo della medicina al plasma [4,5] e il plasma atmosferico freddo (CAP) ha attirato molta attenzione per il suo notevole potenziale di influenzare i processi biologici [2,6]. In questo contesto, è stato esplorato il potenziale del CAP in diverse applicazioni bio-mediche, tra cui la disinfezione, il trattamento delle ferite, il controllo dell’infiammazione, la coagulazione del sangue, la terapia del cancro e la medicina rigenerativa [7,8,9,10,11].

L’efficacia della CAP nelle applicazioni proposte si basa sull’azione sinergica di specie reattive dell’ossigeno (ROS), specie reattive dell’azoto (RNS), radicali liberi, fotoni UV, particelle cariche e campi elettrici [12,13,14,15]. È stato riportato che una bassa dose di ROS e RNS induce la proliferazione e la morte cellulare, mentre un’alta dose di ROS/RNS può danneggiare proteine, lipidi, DNA e indurre l’apoptosi [16,17,18,19]. Alcuni risultati hanno anche indicato che l’esposizione delle cellule tumorali alla CAP ha portato alla produzione di radicali liberi che potrebbero causare la morte cellulare apoptotica [20]. Molti studi sulla CAP per la terapia del cancro hanno indicato che la CAP non danneggia i tessuti normali se applicata ai dosaggi appropriati [21,22,23,24]. Nel complesso, la terapia con CAP è stata introdotta come modalità di trattamento economica, rapida e selettiva per uccidere le cellule tumorali.

La CAP può essere generata da una serie di dispositivi al plasma diversi, come il getto di plasma, la scarica a barriera dielettrica, la scarica a corona e l’arco radente [25,26,27,28]. Il plasma generato da CAP può essere applicato direttamente ai tumori della pelle. Tuttavia, la maggior parte dei tumori si verifica all’interno del corpo, quindi l’irradiazione al plasma non è pratica a causa dell’alta tensione, della formazione di scariche nell’organo, dell’erogazione di gas e del volume della sonda al plasma [29]. Gli effetti biologici del plasma di microdimensioni sono stati studiati in precedenza in vitro e in vivo [29,30,31]. Tuttavia, questi studi non sono riusciti completamente a realizzare il trattamento con CAP in una posizione specifica all’interno del corpo degli animali.

A questo proposito, il glioblastoma è una neoplasia aggressiva altamente maligna del sistema nervoso centrale primario, caratterizzata da crescita rapida, angiogenesi estesa e resistenza a tutte le terapie attuali [32,33]. Le principali limitazioni del trattamento del glioblastoma e l’eventuale recidiva del tumore sono: (1) il cervello è suscettibile di essere danneggiato dalle terapie convenzionali; (2) le cellule tumorali sono molto resistenti alle terapie convenzionali; (3) molti farmaci non sono in grado di attraversare la barriera emato-encefalica per agire sui tumori cerebrali; e (4) il cervello ha una capacità di auto-riparazione molto limitata [32,34]. Pertanto, è necessario sviluppare un dispositivo al plasma con una portata di gas e dimensioni ridotte, che possa essere potenzialmente utilizzato in vivo aggirando i problemi sopra elencati. In questa sede è stato sviluppato un nuovo dispositivo CAP di dimensioni micro (µCAP) che impiega gas elio ed è stato valutato l’effetto del µCAP sul glioblastoma sia in vitro che in vivo.

2. I risultati 2.1. µCAP e spettro ottico

La Figura 1a illustra la configurazione del µCAP utilizzata in questo lavoro. La Figura 1b illustra il trattamento diretto con µCAP, in cui il µCAP è stato utilizzato per trattare il terreno di coltura contenente cellule tumorali di glioblastoma. La Figura 1c mostra il trattamento indiretto di µCAP, in cui il µCAP è stato utilizzato per trattare prima l’acqua deionizzata (DI). Dopo il trattamento, l’acqua DI è stata trasferita al terreno di coltura contenente le cellule (70 µL di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (contenente le cellule) + 30 µL di acqua DI trattata, per un totale di 100 µL). I tempi per il trattamento diretto e indiretto sono stati di 5, 10, 30, 60 e 120 s. La Figura 1d mostra lo spettro dell’He µCAP con una portata di 0,1 L/min. L’identificazione della linea di emissione e delle bande è stata eseguita principalmente secondo [35]. I picchi di 315 nm, 337 nm, 357 nm e 380 nm rappresentano l’intensità di emissione dei fotoni come risultato delle cadute di N2 eccitato dallo stato C3Πu a B3Πg con diversi numeri quantici di vibrazione superiori e inferiori. Il picco a 281 nm rappresenta il fotone emesso da gocce di NO eccitate da A2Σ+ a X2Π [35]. Le bande dell’elio sono state assegnate tra 500 e 750 nm, come mostrato nella Figura 1d. Le specie a una lunghezza d’onda di 309 nm potrebbero essere definite come OH. Entrambe le bande di He tra 250 e 425 nm potrebbero essere definite come ROS/RNS. Le bande di emissione dell’azoto e dell’OH derivano probabilmente dalla fornitura di elio e dall’aria ambiente.

Figura 1. (a) Rappresentazione schematica del setup del plasma atmosferico freddo di dimensioni micro; (b) trattamento diretto con µCAP: il µCAP è stato applicato direttamente alle cellule in DMEM (100 µL); (c) trattamento indiretto con µCAP: L’acqua DI è stata trattata con µCAP e poi applicata alle cellule in DMEM (70 µL di DMEM + 30 µL di acqua DI trattata); (d) Spettro di emissione ottica rilevato dal µCAP He utilizzando l’UV-visibile-NIR, nell’intervallo di lunghezza d’onda 250-850 nm. ROS: specie reattive dell’ossigeno; RNS: specie reattive dell’azoto; CAP: plasma atmosferico freddo; µCAP: micro-sized CAP; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; DI: Deionized; µCAP: micro-sized cold atmospheric plasma; AC: Alternating current.

2.2. Densità di elettroni del getto di He µCAP

Il sistema sperimentale di diffusione a microonde di Rayleigh (RMS) è mostrato nella Figura 2a. La dipendenza del segnale RMS in uscita dai parametri del canale di diffusione può essere espressa come ????=????????????
dove ???? è il coefficiente di proporzionalità (????=263,8 VΩ/cm2) e ???? è il volume del plasma. Il volume della colonna di plasma è stato determinato dalle immagini intensificate del dispositivo ad accoppiamento di carica (ICCD). ???? è la conduttività del plasma secondo la seguente espressione: ????=2. 82×10-4????????????????/(????2+????2????), Ω-1cm-1, dove ???????? è la frequenza delle collisioni elettrone-neutro, ???????? è la densità del plasma e ???? è la frequenza angolare [36,37]. Combinando queste equazioni si ottiene ????????=((????2+????2????)????)/((2,82×10-4????????????)????). Pertanto, possiamo calcolare il numero totale di elettroni nel plasma come ????????=????????????=????(????2+????2????)/(2,82×10-4????????????). Il numero di elettroni di He µCAP è presentato nella Figura 2b e il numero totale di elettroni per un periodo di scarica è 2,4×109.

Figura 2. Schema del setup sperimentale per lo scattering a microonde di Rayleigh (RMS) (a), nonché del numero di elettroni e della tensione di scarica dell’He (b). He: Elio.

2.3. Rilevamento di RNS generato da µCAP

Il trattamento con µCAP dell’acqua DI e del Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) è stato eseguito per indurre cambiamenti nella concentrazione di ROS e RNS in funzione del tempo di trattamento. Come mostrato nella Figura 3, la concentrazione di NO2- nell’acqua DI e nel DMEM trattati con He µCAP aumenta con la durata del trattamento. L’NO2- si origina principalmente come NO (N2 + e →
2N + e, N + O2 → NO + O, 4NO + O2 + 2H2O → 4NO2- + 4H+) [38,39,40], mentre la maggior parte dell’NO si forma in fase gassosa durante l’afterglow pochi millisecondi dopo l’impulso di scarica. La concentrazione di NO2- nel DMEM trattato con He µCAP è superiore a quella dell’acqua DI (p < 0,05 per tutti i tempi di trattamento).

D’altra parte, il DMEM comprende oltre 30 componenti come sali inorganici, aminoacidi e vitamine, mentre l’effetto dell’irradiazione con plasma su questi composti è ancora sconosciuto. Il plasma potrebbe reagire con gli aminoacidi per formare NO2-, il che fornisce una possibile spiegazione della maggiore concentrazione di NO2- nel DMEM rispetto all’acqua DI. I terreni attivati dal plasma producono molte specie, tra cui NO3-. Nel nostro studio precedente, l’intervallo di pH delle soluzioni di plasma era di circa 5,0-6,0 [16]. D’altra parte, diverse concentrazioni di H2O2 mostrano un intervallo di Ph da 4,5 a 6,2. Pertanto, il Ph del Μcap dovrebbe essere compreso tra 4,5 e 6,0.

Figura 3. Concentrazione di RNS in acqua DI (a) e DMEM (b) trattata con µCAP. È stato eseguito il test t di Student e la significatività statistica rispetto al trattamento con µCAP 5 s è indicata come * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (n = 3).

2.4. Valutazione della concentrazione relativa del radicale idrossile

Il blu di metilene (MB) è stato utilizzato per valutare la concentrazione relativa dei radicali idrossilici (-OH). È noto che il MB reagisce con le soluzioni acquose di -OH, provocando un cambiamento di colore visibile [41]. Come mostrato nella Figura 4, la concentrazione relativa di MB diminuisce con il tempo di trattamento di He µCAP. La concentrazione relativa di MB diminuisce del 9,3% dopo il trattamento con He µCAP dell’acqua DI per 120 s. Sebbene questa variazione sia significativa, il DMEM trattato con He µCAP ha mostrato un’azione di degradazione più forte (14,7%), suggerendo che nel DMEM si generano più specie reattive a vita breve. Il plasma reagendo con il DMEM potrebbe formare un nuovo prodotto che reagisce con il blu di metilene, il che potrebbe spiegare perché il DMEM trattato con He µCAP ha mostrato un’azione di degradazione più forte rispetto all’acqua DI. Nel complesso, questi risultati dimostrano che vi è un aumento della concentrazione relativa di -OH in funzione del tempo di trattamento con µCAP.

Figura 4. Concentrazione relativa di blu di metilene (MB) per valutare la concentrazione di radicali liberi idrossilici in acqua DI trattata con µCAP (a) e DMEM (b). È stato eseguito il test t di Student e la significatività statistica rispetto al MB senza trattamento con µCAP (0 s) è indicata come * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (n = 3).

2.5. Rilevamento dei ROS generati da µCAP

La Figura 5 mostra la dipendenza della concentrazione di ROS dal tempo di trattamento in acqua DI e DMEM trattati con µCAP. La generazione di H2O2 potrebbe essere attribuita all’alta densità di elettroni e all’energia del plasma (He →
He+ + e, He+ + H2O → H2O+ + He, H2O+ + H2O → H3O+ + -OH; He + e → He * + e, He * + H2O → He + -OH + H∙; H2O + e → H2O * + e, H2O * → -OH + H∙; -OH + -OH → H2O2) [42,43]. La concentrazione di H2O2 aumenta con la durata del trattamento sia per l’acqua DI che per il DMEM, sebbene la concentrazione di H2O2 generata nell’acqua DI sia superiore a quella del DMEM.

Figura 5. Concentrazione di H2O2 in acqua DI trattata con µCAP (a) e DMEM (b). È stato eseguito il test t di Student e la significatività statistica rispetto al trattamento con µCAP per 5 secondi è indicata come * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (n = 3).

2.6. Vitalità cellulare in seguito alla durata del trattamento µCAP in vitro

La Figura 6a mostra la vitalità cellulare delle cellule di glioblastoma trattate con il trattamento indiretto He µCAP dopo 24 e 48 ore. La vitalità cellulare dopo 24 ore di incubazione (normalizzata con il controllo DMEM) è diminuita di circa il 14,2%, il 19,9%, il 25,4%, il 29,0%, il 34,7% e il 39,2%, in base alla durata del trattamento di 0, 5, 10, 30, 60 e 120 s, rispettivamente. Dopo 48 ore di incubazione, la vitalità cellulare è diminuita di circa il 18,3%, 35,6%, 34,8%, 41,1%, 54,7% e 51,4%, rispettivamente per durate di trattamento di 0, 5, 10, 30, 60 e 120 secondi. La Figura 6b mostra la vitalità cellulare delle cellule di glioblastoma dopo 24 e 48 ore di incubazione con il trattamento diretto con He µCAP (trattamento di 100 µL di terreno contenente le cellule) per una durata di 0, 5, 10, 30, 60 e 120 s. La vitalità cellulare delle cellule di glioblastoma dopo l’incubazione di 24 ore (normalizzata rispetto al controllo) è diminuita di circa il 15,4%, 27,1%, 28,9%, 44,1% e 65,1%, in base alla durata del trattamento di 5, 10, 30, 60 e 120 s, rispettivamente. Riduzioni simili, dose-dipendenti (cioè con l’aumento del tempo di trattamento) della vitalità cellulare sono state riscontrate con un’incubazione di 48 ore.

Figura 6. Vitalità cellulare di U87MG dopo 24 e 48 ore di incubazione con trattamento indiretto (a) e diretto (b) con He µCAP per 0, 5, 10, 30, 60 e 120 s. Le percentuali di cellule sopravvissute per ciascuna linea cellulare sono state calcolate rispetto ai controlli (0 s) in DMEM. È stato eseguito il test t di Student e la significatività statistica rispetto alle cellule presenti in DMEM (0 s) è indicata come * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. (n = 3).

2.7. Targeting in vivo del glioblastoma con µCAP

Per determinare l’effetto del nuovo dispositivo al plasma sul glioblastoma in vivo, abbiamo applicato direttamente l’He µCAP per 15 s ai tumori del glioblastoma nel cervello di topi vivi attraverso un tubo endoscopico impiantato, come mostrato nella Figura 7a. Utilizzando l’imaging in vivo della bioluminescenza (Figura 7b), il volume del tumore in un animale di controllo (solo elio) è aumentato di quasi il 600% nel corso di due giorni, mentre il volume del tumore trattato con He µCAP è diminuito di circa il 50% rispetto ai livelli di base (Figura 7c). Negli animali di controllo si osserva un chiaro aumento del volume tumorale nel corso dei 2 giorni. Al contrario, gli animali trattati con He µCAP sono scesi al di sotto dei valori basali. Questi risultati sorprendenti dimostrano il potenziale di µCAP nell’inibire la crescita del tumore del glioblastoma in vivo.

Figura 7. Targeting in vivo del tumore del glioblastoma con He µCAP. (a) Fotografia di un nuovo dispositivo μCAP per la somministrazione di plasma attraverso un tubo endoscopico intracranico per colpire i tumori del glioblastoma nel cervello di topo; (b) immagini rappresentative di bioluminescenza in vivo che illustrano il volume del tumore del glioblastoma (cioè l’emissione di luce o la radianza) al basale e 2 giorni dopo il trattamento con He µCAP o veicolo (elio). Le aree ad alta emissione di fotoni sono indicate in rosso e quelle a bassa emissione in blu; (c) i dati riassuntivi del gruppo (n = 3/gruppo) indicano che il volume del tumore nel controllo è aumentato in modo aggressivo dopo il trattamento, mentre la somministrazione di He µCAP ha mantenuto il volume del tumore al di sotto dei livelli basali.

3. Discussione

La CAP ha ricevuto una notevole attenzione per le sue potenziali applicazioni biomediche. I campi di applicazione emergenti della CAP comprendono la guarigione delle ferite, la sterilizzazione dei tessuti infetti, l’inattivazione dei microrganismi, lo sbiancamento dei denti, la coagulazione del sangue, la rigenerazione della pelle e la terapia del cancro. Tutto ciò è stato definito collettivamente “medicina del plasma”. Le applicazioni dirette e indirette della PAC si sono dimostrate efficaci per il trattamento di varie cellule tumorali in vitro e in vivo [11]. Tuttavia, come discusso in precedenza, il trattamento dei tumori in profondità è stato ostacolato dai limiti degli strumenti di somministrazione della CAP. Pertanto, ci siamo proposti di sviluppare e studiare come l’applicazione di un nuovo dispositivo He µCAP possa indurre un’elevata morte cellulare sia in vitro che in vivo.

Il trattamento dei terreni di coltura contenenti cellule (trattamento diretto) è stato confrontato con il trattamento dell’acqua DI e la sua rimozione dai terreni di coltura contenenti cellule (trattamento indiretto). I nostri risultati suggeriscono che entrambi i trattamenti He µCAP, diretto e indiretto, possono indurre un’elevata morte cellulare nelle cellule di glioblastoma (Figura 6), anche se in generale il trattamento diretto è stato più efficace di quello indiretto. Il plasma contiene ioni energetici, radicali liberi, specie reattive, radiazioni UV e campi elettrici transitori inerenti alla somministrazione del plasma, che interagiscono con le cellule e altri organismi viventi. In molti casi, è stato riportato che l’apoptosi indotta dal plasma nelle cellule tumorali non ha avuto effetti negativi sulle cellule normali quando è stato somministrato a un dosaggio paragonabile a quello fornito alle cellule tumorali [11,44,45]. La sezione d’urto dell’assorbimento dei ROS nell’intervallo spettrale UV (10-400 nm) è relativamente piccola [46] e le linee di specie tra 300 e 350 non sono ancora chiaramente determinate. I radicali e gli elettroni generati durante la formazione del plasma possono avere vita breve o lunga. Questi radicali o elettroni raggiungono la soluzione e danno vita a molte reazioni complesse, che portano alla formazione di altri radicali o specie a vita breve e lunga. I radicali o le specie a vita breve includono il superossido (O2-), il nitrito (NO), l’ossigeno atomico (O), l’ozono (O3), il radicale idrossile (-OH), l’ossigeno delta singoletto (SOD, O2 (1∆????) e il perossinitide. )) e perossinitrito (ONOO-), ecc. [47,48]. Le specie a lunga vita includono il perossido di idrogeno (H2O2) e il nitrito (NO2-) [48].

Nel caso del trattamento indiretto µCAP (trattamento dell’acqua DI e trasferimento alle cellule in un terreno di coltura), si può sostenere che gli effetti primari sono associati alle specie a lunga vita (H2O2 e NO2-). È noto che gli RNS inducono la morte cellulare tramite danni al DNA, mentre i ROS possono indurre la morte cellulare tramite apoptosi e necrosi [49,50].

Quando si utilizza l’He come gas di trasporto, la concentrazione di H2O2 e NO2- nell’acqua DI aumenta con il tempo (Figura 3 e Figura 5). Analizzando la vitalità cellulare, si può notare che l’He µCAP ha un forte effetto sulle cellule tumorali di glioblastoma (U87MG). La concentrazione di H2O2 e NO2- generata dal µCAP aumenta con il tempo di trattamento, in linea con l’aumento lineare dell’efficienza di uccisione delle cellule tumorali. Tuttavia, potrebbero esistere ulteriori vie antitumorali correlate a H2O2 e NO2-. Ad esempio, si ritiene che H2O2 e NO2- generino perossinitrito (H2O2 + 2NO2- →
2HONOO-) che è noto per essere tossico per le cellule [51]. L’HONOO- è stabile a pH basico (acqua DI < 6) altrimenti si decompone immediatamente in NO3-. Tuttavia, l’HONOO- può essere difficile da generare nei terreni di coltura perché questi sono tamponati e solo leggermente basici (pH > 7) [52].

D’altra parte, le acquaporine (AQPs) svolgono un ruolo critico nel facilitare la diffusione passiva di H2O2, in particolare l’AQP8 [45,53,54,55]. Non tutte le AQP possono trasportare H2O2 e le AQP mostrano vari gradi di trasporto di H2O2 in diversi tipi di tumori umani. Le AQP1, 4, 8 e 9 sono altamente espresse nelle linee cellulari di glioblastoma [45,56]. Pertanto, il modello di espressione distinto di AQP8 nel glioblastoma potrebbe essere responsabile della sensibilità delle cellule tumorali ad alte concentrazioni di H2O2.

Plasma atmosferico freddo per l’ablazione selettiva delle cellule di cancro al seno metastatico (Sotto)

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L’effetto di specie o radicali sia a breve che a lunga vita è plausibile se si considerano le cellule di glioblastoma trattate direttamente con µCAP (in vitro, Figura 6) e i tumori nel cervello di topo (in vivo, Figura 7). È da notare che il DMEM comprende oltre 30 componenti come sali inorganici, aminoacidi e vitamine e l’effetto dell’irradiazione del plasma su questi composti è ancora sconosciuto. Analogamente, anche l’effetto dell’irradiazione al plasma sul cervello murino è sconosciuto. Pertanto, specie reattive o radicali sconosciuti potrebbero essere generati durante l’irradiazione del DMEM e durante l’applicazione in vivo. Le specie o i radicali a vita breve e lunga nel DMEM e nel cervello dei topi contengono -OH, NO, O2-, O, O3, O2 (1∆????
), ONOO-, H2O2 e NO2- sono componenti di spicco dell’azione antitumorale del plasma [57].

La concentrazione relativa di -OH nel DMEM trattato con He µCAP aumenta con il tempo di trattamento (Figura 4). Il cambiamento di colore del blu di metilene mostra la presenza di radicali OH attraverso lo sbiancamento immediato e distinto del colorante blu di metilene (analisi qualitativa) [41]. -I perossidi di aminoacidi derivati da -OH possono contribuire al danno cellulare perché gli stessi -OH e i perossidi di proteine (aminoacidi) sono in grado di reagire con il DNA, inducendo così varie forme di danno [58,59]. Quando He µCAP attiva il DMEM, la concentrazione di H2O2 e NO2- aumenta con il tempo di trattamento (Figura 3 e Figura 5), e il sinergismo di H2O2 e NO2- menzionato sopra potrebbe essere un fattore importante.

La CAP produce anche una quantità significativa di ozono (O3), che è noto avere un effetto fortemente aggressivo sulle cellule [60]. L’ozono ha un ruolo nella formazione di ROS e RNS biologicamente attivi nei mezzi acquosi, che possono essere responsabili della morte cellulare [61,62]. Si ritiene che l’ossigeno atomico (O) (compreso lo stato fondamentale e tutti gli stati eccitati) abbia un effetto significativo sulle cellule [63,64]. Il superossido (O2-) generato dal plasma può attivare l’apoptosi mediata dai mitocondri modificando il potenziale di membrana mitocondriale e contemporaneamente up-regola i geni pro-apoptotici e down-regola i geni anti-apoptotici per l’attivazione delle caspasi con conseguente morte cellulare [65]. L’ossigeno delta singoletto O2 (1∆????) è un altro importante ROS con un’energia di eccitazione di 0,98 eV. La molecola altamente reattiva O2 (1∆????) non solo produce danni ossidativi in molti bersagli biologici, ma è anche una specie attiva primaria nell’uccisione selettiva delle cellule tumorali nella terapia del cancro emergente [66,67]. Inoltre, il nitrito (NO2-) e il superossido (O2-) possono facilmente formare ONOO- una volta che si scontrano [68].

L’ONOO- è un potente ossidante e agente nitrante, noto per essere altamente dannoso per le cellule tumorali [69]. Nel complesso, i risultati e la discussione di cui sopra indicano che le vie dirette e indirette di somministrazione di CAP potrebbero essere utili e dovrebbero essere prese in considerazione in un’applicazione medica clinica. Un’ulteriore comprensione dei precisi meccanismi sottostanti consentirà di determinare la combinazione “migliore” da utilizzare come strategia terapeutica.

4. Materiali e metodi

4.1. Configurazione del dispositivo sperimentale

Nella Figura 1a, il dispositivo µCAP è costituito da un insieme di due elettrodi (in rame) con un elettrodo centrale alimentato e un elettrodo esterno collegato a terra avvolto all’esterno di un tubo di quarzo (10 mm). Gli elettrodi sono stati collegati all’uscita secondaria di un trasformatore ad alta tensione. La tensione di picco-picco era di circa 8 kV e la frequenza della scarica era di circa 15 kHz. L’uscita secondaria del trasformatore ad alta tensione è stata collegata al primo ingresso. La potenza del primo ingresso è di circa 5 watt. All’estremità del tubo di quarzo è stato fissato un tubo capillare di 70 ± 3 µm di diametro interno (acciaio inossidabile) con una lunghezza di 20 mm, isolato con resina epossidica. Il gas di alimentazione per questo studio era elio di purezza industriale, iniettato nel tubo di quarzo con una portata di 0,1 L/min.

4.2. Misura degli spettri di spettroscopia di emissione ottica (OES)

L’UV-visibile-NIR, con un intervallo di lunghezza d’onda di 200-850 nm, è stato studiato sul plasma per rilevare vari RNS e ROS (azoto [N2], ossido nitrico [-NO], catione di azoto [N+2], ossigeno atomico [O] e radicali idrossilici [-OH]). Lo spettrometro e la sonda di rilevamento sono stati acquistati da Stellar Net Inc. (Tampa, FL, USA). La sonda ottica è stata posizionata a una distanza di 1,0 cm davanti all’ugello del getto di plasma. I dati sono stati raccolti con un tempo di integrazione di 100 ms.

4.3. Sistema di diffusione a microonde di Rayleigh (RMS) per la misurazione del numero di elettroni

Il sistema sperimentale RMS è presentato schematicamente nella Figura 2a. Per la radiazione e la rilevazione del segnale a microonde sono state utilizzate due trombe a microonde. La radiazione a microonde polarizzata linearmente è stata diffusa sul canale del plasma orientato collinearmente e il segnale diffuso è stato poi misurato. Il rilevamento del segnale diffuso è stato effettuato utilizzando uno schema omodina per mezzo di un mixer I/Q, che fornisce uscite in fase (I) e in quadratura (Q). Per l’intera gamma di segnali diffusi, gli amplificatori e il mixer hanno funzionato in modalità lineare. L’ampiezza totale del segnale a microonde diffuso è stata determinata da: ????=????2+????2——√
.
4.4. Coltura cellulare

Le cellule di glioblastoma umano (U87MG, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) sono state coltivate in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies, Washington, WA, USA) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (Atlantic Biologicals, Frederick, MD, USA) e l’1% (v/v) di penicillina e streptomicina (Life Technologies). Le colture sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato contenente il 5% (v/v) di CO2.

4.5. Determinazione della concentrazione di H2O2

Per misurare la quantità di H2O2 è stato utilizzato un kit fluorimetrico per il dosaggio del perossido di idrogeno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), secondo il protocollo del produttore. In breve, 50 μL di curva standard, di controllo e di campioni sperimentali sono stati aggiunti a piastre nere a fondo piatto da 96 pozzetti, quindi 50 μL di Master Mix sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Le piastre sono state incubate per 20 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce e la fluorescenza è stata misurata da un lettore di micropiastre Synergy H1 Hybrid Multi-Mode a Ex/Em: 540/590 nm.
4.6. Determinazione della concentrazione di NO2-

Il plasma atmosferico freddo nella terapia del cancro (Sotto)

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I livelli di RNS sono stati determinati utilizzando il Griess Reagent System (Promega Corporation, Madison, WI, USA) secondo le istruzioni fornite dal produttore. In breve, 50 μL di campioni e 50 μL della soluzione di sulfanilamide fornita sono stati aggiunti a piastre a fondo piatto da 96 pozzetti e incubati per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, 50 μL della soluzione NED sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati a temperatura ambiente per 5-10 minuti. L’assorbanza è stata misurata a 540 nm con un lettore di micropiastre Synergy H1 Hybrid Multi-Mode.

4.7. Accumulo di -OH in una soluzione di blu di metilene (MB)

Una soluzione di MB è stata preparata sciogliendo la potenza del MB in acqua DI e DMEM. Le soluzioni di MB (100 μL per pozzetto, 0,01 g/L) in una piastra nera a fondo piatto da 96 pozzetti sono state trattate con He µCAP per 5, 10, 30, 60 e 120 s. Lo spazio tra l’uscita del µCAP e la superficie dei campioni era di circa 3 mm. Come controllo, due soluzioni di MB non trattate in triplo sono state trasferite in una piastra nera a 96 pozzetti a fondo piatto. Il cambiamento di colore del blu di metilene mostra la presenza di radicali OH attraverso lo sbiancamento immediato e netto del colorante blu di metilene (analisi qualitativa). Il cambiamento di colore della soluzione di MB è stato misurato come assorbanza a 664 nm da un lettore di micropiastre Synergy H1 Hybrid Multi-Mode.

4.8. Vitalità cellulare in seguito al trattamento indiretto con µCAP in vitro

Le cellule U87 sono state collocate in micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti a una densità di 3000 cellule per pozzetto in 70 μL di terreno di coltura completo. Le cellule sono state incubate per 24 ore per garantire una corretta adesione e stabilità cellulare. Il giorno 2, 30 μL di acqua DI sono stati trattati con He µCAP per 0, 5, 10, 30, 60 e 120 s e sono stati aggiunti alle cellule. Le cellule sono state poi incubate a 37 °C per 24 e 48 ore. La vitalità cellulare delle cellule di glioblastoma è stata misurata per ciascun tempo di incubazione con un test al 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). A ciascun pozzetto è stato aggiunto un volume di 100 μL di soluzione MTT (Sigma-Aldrich), seguito da un’incubazione di 3 ore. La soluzione MTT è stata scartata e sono stati aggiunti 100 μL per pozzetto di solvente MTT (0,4% (v/v) HCl in isopropanolo anidro). L’assorbanza della soluzione viola è stata registrata a 570 nm con un lettore di micropiastre Synergy H1 Hybrid Multi-Mode.

4.9. Vitalità cellulare dopo il trattamento diretto con µCAP in vitro

Le cellule U87 sono state inserite in micropiastre a fondo piatto da 96 pozzetti a una densità di 3000 cellule per pozzetto in 100 μL di terreno di coltura completo. Le cellule sono state incubate per 24 ore per garantire una corretta adesione e stabilità cellulare. Il giorno 2, le cellule sono state trattate con He µCAP per 0, 5, 10, 30, 60 e 120 s. Le cellule sono state poi incubate a 37 °C per 24 e 48 ore. Per valutare la vitalità cellulare è stato utilizzato un saggio MTT come descritto sopra.

4.10. Applicazione in vivo di µCAP per colpire il glioblastoma intracranico

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal George Washington University Institutional Animal Care and Use Committee. Topi atimici nudi di otto settimane (Charles River, NU(NCr)-Foxn1nu) sono stati anestetizzati per via intraperitoneale (Ketamina (100 mg/kg) mista a Xilazina (10 mg/kg)) e posizionati in un telaio stereotassico. La superficie del cranio è stata visualizzata con un microscopio da dissezione e livellata orizzontalmente tra bregma e lambda.

Sistema e metodo per il trattamento del cancro attraverso danni al DNA Plasma atmosferico freddo con modelli auto-organizzati (Background dell’invenzione Sotto )

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È stato praticato un piccolo foro nella posizione desiderata. Le cellule U87MG-RedFluc (Perkin Elmer), contenenti una lucciola luciferasi spostata in rosso che consente il monitoraggio in vivo della crescita tumorale attraverso l’emissione di luce, sono state risospese in DMEM a una concentrazione di 5 × 105 cellule/µL e iniettate nel lobo frontale alle seguenti coordinate (rispetto a Bregma) utilizzando una siringa di Hamilton: 2,2 mm ventrali dalla superficie dorsale del cranio, 1,0 mm caudali e 2,0 laterali.

Quindi, sono state iniettate 5 × 105 cellule a una profondità di 2,2 mm; la siringa è stata poi ritratta a 1,8 mm e sono state somministrate altre 5 × 105 cellule. Per consentire la somministrazione di µCAP, è stato quindi impiantato un tubo endoscopico a una profondità di 2,2 mm e fissato in posizione con cemento dentale. I topi sono stati lasciati recuperare per 7 giorni e poi è stato somministrato He µCAP o il veicolo di controllo (He da solo). In breve, i topi sono stati anestetizzati con isofluorano e la CAP è stata applicata attraverso il tubo endoscopico impiantato a intervalli di 5 s, seguiti da 15 s di pausa, per un tempo totale di trattamento CAP di 15 s. Il getto è stato rimosso dal tubo endoscopico per consentire lo sfiato dell’He. Le dimensioni del tumore sono state stimate utilizzando l’imaging bioluminescente in vivo prima e fino a 48 ore dopo il trattamento con CAP o veicolo.

Per l’imaging bioluminescente, gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano e il substrato luciferina è stato somministrato i.p. (150 mg/kg). I topi sono stati poi trasferiti nella cabina di imaging a tenuta di luce di una macchina IVIS Lumina K e posizionati in un cono nasale per mantenere l’anestesia. Le immagini bioluminescenti sono state acquisite utilizzando una telecamera con dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddata a -80 °C per ottenere la massima sensibilità. Le immagini sono state acquisite 10 minuti dopo l’iniezione del substrato con un tempo di esposizione di 20 s, binning medio, F/Stop = 1 e guadagno EM disattivato.

4.11. Definizione di controllo

Nella Figura 4 e nella Figura 6, ci sono trattamenti “0 s”, che rappresentano nessun trattamento µCAP usato come controllo.

4.12. Analisi statistica

I risultati sono stati tracciati con Origin 8 come media ± deviazione standard. Il test t di Student è stato utilizzato per verificare la significatività statistica (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001).

5. Conclusioni

In sintesi, è stato dimostrato l’effetto di una µCAP di nuova concezione sul glioblastoma sia in vitro che in vivo. Al µCAP sono stati applicati diversi strumenti diagnostici, tra cui la spettroscopia di emissione ottica, lo scattering a microonde e la misurazione del potenziale, che hanno fornito prove delle reazioni delle specie generate dal plasma nei mezzi di comunicazione e nel cervello del topo. Il trattamento diretto con µCAP ha un effetto più forte di quello indiretto grazie all’effetto sinergico delle specie a breve e lunga vita, mentre il forte effetto del trattamento indiretto con µCAP sulle cellule tumorali è probabilmente attribuito all’azione delle specie a lunga vita. Il µCAP è sicuro per i topi e sopprime la crescita tumorale nel cervello dei topi. Queste osservazioni iniziali stabiliscono che il µCAP è una terapia ablativa potenzialmente utile nel glioblastoma.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation, sovvenzione n. 1465061, e dal George Washington Institute for Biomedical Engineering Interdisciplinary Research Fund. Si ringrazia Ka Bian del Dipartimento di Biochimica e Medicina Molecolare della George Washington University per il supporto agli esperimenti di misurazione dei ROS e RNS.

Contributi degli autori

Zhitong Chen, Hayk Simonyan, Xiaoqian Cheng, Eda Gjika, Li Lin, Jerome Canady, Jonathan H. Sherman, Colin Young e Michael Keidar hanno contribuito alla progettazione e all’analisi dello studio e alla stesura del rapporto. Tutti gli autori hanno approvato la bozza finale del rapporto.

Conflitti di interesse

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Fonti: purdue.edu & rexresearch.com & doi.org & Archivi Privati

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