“Turbo Cancer” Uno Studio Approfondito Mostra come i Microfogli di Grafene Entrano nelle Cellule Attraverso la Penetrazione Spontanea della Membrana!
Noi non sappiamo come mai è sorto improvvisamente il turbo cancro, ma qualcosa deve essere successo!
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“Turbo Cancer”
Questa sintesi descrive uno studio incentrato sul modo in cui il grafene e il grafene a pochi strati (FLG) interagiscono con le membrane cellulari. Si tratta di un aspetto cruciale per il progresso delle applicazioni biomediche e per garantire la sicurezza nella manipolazione del grafene.

La ricerca combina tecniche sperimentali e simulazioni per studiare il comportamento dei materiali di grafene in ambienti biologici. I risultati e i metodi principali includono:
1. immagini e osservazioni:
Gli esperimenti condotti con la fluorescenza confocale e la microscopia elettronica hanno dimostrato che il grafene penetra nelle cellule prima sui bordi, portando a una completa internalizzazione.
Questo comportamento è stato osservato in vari campioni FLG con dimensioni laterali comprese tra 0,5 e 10 μm.
2. simulazioni e barriere energetiche:
Le simulazioni di dinamica molecolare (sia a grana grossa che a livello atomico) hanno mostrato elevate barriere energetiche per la penetrazione diretta degli strati di grafene nelle membrane, indicando che il semplice passaggio della membrana è energeticamente sfavorevole.
3. meccanismo di penetrazione:
Simulazioni dettagliate hanno identificato che i bordi irregolari, gli angoli e le sporgenze degli strati di grafene forano localmente la membrana. Queste strutture taglienti avviano un processo in cui la membrana si diffonde lungo il bordo dello strato di grafene, aggirando la barriera energetica altrimenti elevata.
4. consistenza dell’assorbimento cellulare:
Il meccanismo proposto spiega come le cellule possano assorbire grandi fogli di grafene ed è coerente con i risultati di bioimaging osservati nei cheratinociti umani, nelle cellule epiteliali polmonari e nei macrofagi murini.
Implicazioni
Questo studio fornisce indicazioni su come la struttura fisica del grafene influenzi le sue interazioni con le membrane biologiche e sottolinea l’importanza della struttura dei bordi per l’assorbimento delle cellule. Questi risultati sono importanti per lo sviluppo di strumenti biomedici basati sul grafene e per la valutazione dei potenziali rischi per la salute associati all’esposizione al grafene.
Il grafene è un materiale 2D simile a una lastra, costituito da un singolo strato di atomi di carbonio disposti esagonalmente, con straordinarie proprietà elettriche(1), meccaniche(2) e termiche(3). Il grafene bilayer, trilayer(4), a pochi strati e le strutture multistrato con spessore <100 nm sono nanomateriali strettamente correlati, spesso prodotti per esfoliazione termica della grafite e spesso presenti come polveri secche durante la lavorazione(5), il che aumenta la probabilità di esposizione sul luogo di lavoro. Ai fini del presente articolo, ci riferiamo a questo insieme di strutture come “nanomateriali della famiglia del grafene” (GFN)(6). Molti GFN hanno diametri aerodinamici inferiori a 5 μm e rientrano quindi nella categoria dei materiali potenzialmente respirabili.
Anche i GFN con grandi dimensioni laterali (>20 μm) rientrano tipicamente nell’intervallo potenzialmente respirabile e per questi la grande dimensione laterale rappresenta una sfida per la clearance mediata dai macrofagi, sollevando la possibilità di lunghi tempi di permanenza nel polmone(7). Misure sul posto di lavoro e simulazioni di laboratorio hanno documentato la potenziale esposizione umana per inalazione ai nanomateriali ingegnerizzati durante diverse fasi dei processi produttivi(8).
Oltre all’inalazione di polveri secche, i nanomateriali a base di carbonio possono diffondersi nell’aria durante la sonicazione di particelle in sospensione(9) e durante il taglio o la perforazione di materiali compositi. Oltre alle esposizioni professionali, i GFN possono essere deliberatamente impiantati o iniettati per applicazioni biomediche che includono biosensori(10), impalcature per tessuti(11, 12), vettori per la somministrazione di farmaci(13, 14) o la terapia genica(15), agenti antibatterici(16) e sonde di bioimmagine(17, 18). L’ampia superficie specifica del grafene consente una biofunzionalizzazione o un carico di farmaci ad alta densità(19, 20) e una capacità di targeting tumorale più efficiente(13); inoltre, il grafene può offrire una minore tossicità e una migliore riproducibilità di produzione rispetto ad altre piattaforme di materiali(18, 21).
Le dimensioni laterali dei GFN coprono ordini di grandezza, da 10 nm a >100 μm (più grandi della maggior parte delle cellule bersaglio), e le dimensioni massime di un nanomateriale sono importanti per l’assorbimento cellulare, la clearance renale, il trasporto della barriera emato-encefalica e molti altri fenomeni biologici. Fogli a base di grafene di piccole dimensioni laterali (<100 nm) sono in fase di sviluppo per la somministrazione di farmaci e applicazioni diagnostiche. È stato osservato che questi “nanosheet” entrano nelle cellule(6, 13-15, 17, 18) e la loro traslocazione di membrana è stata studiata sperimentalmente(22) e mediante simulazione(23, 24).
Titov e collaboratori hanno condotto simulazioni di dinamica molecolare a grana grossa per studiare l’interazione di piccoli nanoscheletri di grafene e di pochi strati di grafene (FLG) con un bilayer lipidico e hanno riportato strutture ibride grafene-lipide stabili(23). Guo et al. hanno studiato la traslocazione di piccoli nanosheet di grafene attraverso i bilayer lipidici e i loro effetti sulla deformazione della membrana(24).
Si sa molto meno sulle interazioni cellulari fondamentali dei materiali di grafene con dimensioni laterali su scala micrometrica (microfogli di grafene), che sono una delle principali spinte dell’attuale sviluppo dei materiali di grafene. L’urgenza di sviluppare linee guida per la produzione di diagnosi e terapie biomediche più sicure(6, 18), nonché per la regolamentazione dell’esposizione professionale e ambientale(25, 26), giustifica sforzi significativi per chiarire i meccanismi di interazione della membrana cellulare con i nanomateriali di carbonio e con i microfogli di grafene in particolare.
Studi precedenti sull’ingresso dei nanotubi di carbonio nella membrana cellulare hanno suggerito l’esistenza di una dimensione strutturale critica dell’ordine dello spessore del bilayer (circa 4 nm), al di sotto della quale diventa possibile la penetrazione diretta nel bilayer e al di sopra della quale è necessaria l’endocitosi mediata dai recettori per l’assorbimento(27-29). Il grafene è atomicamente sottile in una dimensione, ma tipicamente grande in altre due dimensioni, e il nostro lavoro di modellazione preliminare ha mostrato grandi barriere energetiche per la penetrazione nella membrana anche quando i fogli monostrato incontrano il bilayer lipidico per primo.
Le barriere all’ingresso sono risultate ancora più grandi per i materiali di grafene multistrato, che sono di particolare interesse nel nostro studio a causa della produzione su larga scala tramite esfoliazione. Nella fase preliminare non era chiaro quali tipi di materiali di grafene (quale gamma di numeri di strati e dimensioni laterali) sarebbero stati in grado di entrare nelle cellule e con quale meccanismo biofisico.

Abbiamo quindi condotto uno studio accoppiato sperimentale e computazionale delle interazioni grafene-membrana, utilizzando la dinamica molecolare e l’imaging cellulare in vitro, con particolare attenzione alla geometria e alla dinamica della penetrazione e dell’assorbimento delle cellule. Le simulazioni utilizzano metodi di grana grossa simili a quelli del nostro precedente studio sull’ingresso in punta di nanotubi di carbonio e materiali 1D correlati(30), ma richiedono una risoluzione spaziale più elevata a causa dello spessore atomico del grafene.
Abbiamo studiato i meccanismi su scala atomica dell’interazione delle cellule con i microfogli di grafene a pochi strati mediante simulazioni di dinamica molecolare a grana grossa (CGMD) e di dinamica molecolare guidata a tutti gli atomi (SMD). Le simulazioni CGMD illustrano il processo dinamico dell’interazione grafene-bilayer, mentre le simulazioni SMD ci permettono di determinare le barriere energetiche associate alla penetrazione iniziale del grafene.
Le simulazioni SMD prevedono che i fogli di grafene idealizzati con bordi lisci non penetrino nei bilayer lipidici a temperatura ambiente a causa delle elevate barriere energetiche, anche nei casi in cui l’incontro iniziale avviene rigorosamente sul bordo. L’esame dei microfogli di grafene effettivamente fabbricati rivela topografie dei bordi molto irregolari, per cui abbiamo sviluppato un trattamento teorico separato dell’interazione grafene-bilayer iniziata in corrispondenza di angoli o sporgenze taglienti.
Quest’ultimo modello prevede che l’assorbimento cellulare possa essere avviato da una perforazione spontanea e localizzata della membrana in corrispondenza di angoli o asperità, seguita da una propagazione spontanea lungo il bordo del grafene per raggiungere la penetrazione completa. Queste nuove previsioni del modello sono convalidate dalla bioimmagine a fluorescenza confocale e dalla microscopia elettronica, che mostrano la penetrazione della membrana prima sul bordo o sugli angoli e la completa internalizzazione cellulare per una serie di microfogli di grafene a pochi strati e tre tipi di cellule.
Risultati e discussione
Dinamica molecolare a grana grossa.
La Fig. 1 mostra i risultati della CGMD per il grafene e il grafene a pochi strati che interagiscono con i bilayer lipidici. Nella prima serie di simulazioni, un piccolo fiocco di grafene monostrato rombico con lunghezza del bordo di 6,4 nm è posto inizialmente a una distanza di circa 4 nm sopra e parallelamente a un patch quadrato di bilayer lipidico con 992 molecole lipidiche e 67.817 molecole d’acqua in una scatola cubica con dimensione del bordo di 24 nm(Fig. 1A). Le condizioni al contorno periodiche sono imposte in tutte e tre le dimensioni.
In presenza di fluttuazioni termiche, il fiocco di grafene subisce un moto browniano, che comprende rapide vibrazioni, rotazioni e migrazioni in prossimità del bilayer. Si osserva che il piercing spontaneo nel bilayer inizia non appena il fiocco trova una configurazione con uno dei suoi angoli più acuti orientato quasi ortogonalmente alla membrana(Fig. 1 B e C). La perforazione è facilitata dalle interazioni attrattive tra il grafene e i gruppi di coda dei lipidi, ma avviene solo dopo che la punta dell’angolo penetrante tocca il nucleo idrofobico del bilayer. Nelle nostre simulazioni in computer grafica, la membrana lipidica può essere completamente attraversata dal fiocco di grafene, accompagnato dall’inclinazione del fiocco di grafene per massimizzare la sua copertura con l’interno della membrana. Il piccolo fiocco di grafene nella nostra simulazione finisce per essere incorporato nel bilayer a causa delle sue piccole dimensioni(filmato S1).
La serie di campioni di GFN utilizzati nei nostri studi di bioimmagine ha rapporti C/O che variano da 10 a 32 secondo la spettroscopia di fotoelettroni a raggi X(31), con atomi di ossigeno che si presume si trovino su siti di margine e di difetto. Inoltre, è stato misurato che la quantità di proteine adsorbite copre il 3-46% dell’area superficiale del GFN, a seconda delle condizioni e del campione(SI Text). Per indagare questi effetti, ulteriori simulazioni CGMD dell’interazione del bilayer con fiocchi di grafene di diversa forma e chimica di superficie (diverse funzionalizzazioni di angoli e bordi e proprietà idrofile/idrofobiche) confermano che i fogli di grafene di piccole dimensioni tendono a penetrare nella cellula attraverso la perforazione spontanea dell’angolo idrofobico più acuto.
Sono stati eseguiti anche una serie di calcoli con diversi parametri di interazione tra grafene e molecole lipidiche per dimostrare che la modalità di ingresso dell’angolo è robusta entro un ampio intervallo di parametri di dinamica dissipativa delle particelle (DPD)(SI Text). Dimostreremo a breve che l’orientamento quasi ortogonale di un angolo di grafene rispetto al bilayer minimizza la loro energia libera interattiva ed è la configurazione termodinamicamente preferita anche prima dell’inizio della penetrazione.

(A-H) Simulazioni di dinamica molecolare a grana grossa delle interazioni tra un bilayer lipidico e(A-D) un piccolo fiocco di grafene o(E-H) un grande foglio di grafene a cinque strati con impilamento sfalsato e topografia dei bordi ruvida. (I) L’energia libera normalizzata del sistema in funzione dell’orientamento del grafene quando uno degli angoli più acuti è fissato a una distanza di 0,5 nm sopra il bilayer. Si noti che A-D e F-H sono sequenze temporali; E è una struttura sperimentale del bordo del grafene(34-36).
Abbiamo anche eseguito simulazioni CGMD di grandi fogli di grafene a pochi strati che interagiscono con bilayer lipidici(Fig. 1 F-H). Abbiamo iniziato studiando un bordo di grafene ideale, atomicamente liscio e infinito, che interagisce con i bilayer lipidici, ma non abbiamo osservato la penetrazione (SI Text, Fig. S6A, e Discussione). Ci siamo resi conto che i bordi del grafene fabbricato sperimentalmente presentano una rugosità su scala atomica(Fig. 1E), come si evince dalla microscopia a scansione tunneling a risoluzione atomica(32-34), e anche la maggior parte dei fogli di grafene a pochi strati presenta bordi molto ruvidi (vedi Fig. 4), nonché strutture a terrazze o smussate che diventano sempre più sottili verso una delle due facce(35, 36). La Fig. 1F mostra un modello di struttura a terrazze creata su un fiocco FLG a cinque strati che interagisce con un bilayer.
Il sistema di simulazione consiste in un patch di bilayer con 2.016 molecole lipidiche e 133.052 molecole d’acqua in un box cubico di dimensioni 24 nm × 48 nm × 24 nm. L’FLG, simile a una lastra, con una topografia a bordi irregolari che imita quella osservata negli esperimenti, è composto da cinque strati atomici con una distanza interstrato di equilibrio di 0,34 nm e posizionati inizialmente a una distanza di circa 3 nm sopra e ortogonalmente al bilayer. A ogni strato di grafene è assegnato un colore diverso. I primi due e gli ultimi due strati sono impostati per essere simmetrici rispetto allo strato intermedio. Per simulare parte di una struttura molto più grande, per la quale il moto browniano è limitato, il bordo superiore dell’FLG viene bloccato e vengono imposte condizioni al contorno periodiche in tutte e tre le dimensioni del box di simulazione.
Il bilayer lipidico subisce un moto browniano in prossimità del grande bordo di grafene per 2,19 μs sotto il confinamento di un potenziale armonico. Quest’ultimo viene poi rimosso e la membrana bilayerica è libera di interagire con il bordo di grafene irregolare. Si vede che l’FLG penetra nel bilayer nonostante le sue dimensioni, iniziando con una perforazione localizzata in corrispondenza di sporgenze taglienti lungo il bordo. La porzione di membrana penetrata si propaga poi lungo l’intero bordo, dando luogo a una penetrazione completa filmato S2). In questo processo, la barriera energetica alla penetrazione è superata da perforazioni locali in corrispondenza di angoli acuti lungo il bordo nominalmente piatto, e la penetrazione completa è guidata dall’interazione attrattiva tra il grafene e i gruppi di coda dei lipidi una volta che la perforazione iniziale è riuscita.
Abbiamo testato la robustezza di questa modalità di ingresso effettuando ulteriori simulazioni CGMD su lamelle di grafene monostrato o a pochi strati con una sporgenza isolata o una terrazza o iniziando il contatto in prossimità di un angolo o di un bordo localmente ripiegato(SI Text e Figg. S2-S7). I risultati delle simulazioni mostrano tutti percorsi simili, iniziati da una perforazione localizzata in corrispondenza di un elemento di grafene atomicamente sottile, che richiede solo energia termica per superare la piccola barriera, seguita dalla diffusione e dalla penetrazione completa guidata dalle forze idrofobiche tra il grafene e il nucleo del bilayer.
Riteniamo che questo meccanismo di ingresso possa essere generico per l’assorbimento cellulare di tutti i nanomateriali idrofobici 2D con spessore su scala atomica. L’importanza della perforazione localizzata degli angoli per l’innesco dell’ingresso può essere dimostrata anche effettuando simulazioni su bordi di grafene ideali, atomicamente lisci e infiniti, senza le caratteristiche irregolari osservate nei campioni reali. In questo caso, le nostre simulazioni mostrano che il bilayer lipidico viene respinto dal bordo di grafene a causa di una combinazione di una forte barriera energetica di ingresso e di interazioni entropiche tra il bilayer e un bordo di grafene atomicamente liscio (SI Text e Fig. S6A).
Quest’ultima simulazione è stata fatta per dimostrare ulteriormente l’importanza della perforazione locale come evento iniziatore, ma non corrisponde ad alcuno scenario di esposizione biologica noto, perché richiederebbe il contatto della cellula con una struttura uniforme, atomicamente liscia, allineata orizzontalmente e di lunga lunghezza del bordo di grafene, difficile da ottenere nella pratica.
Simulazioni di tutti gli atomi.
Le nostre simulazioni CGMD suggeriscono che la perforazione localizzata degli angoli svolge un ruolo critico durante la fase iniziale dell’assorbimento cellulare del grafene. Per determinare l’evoluzione dell’energia associata a questi eventi iniziali di perforazione, sono state condotte ulteriori simulazioni su un modello a tutti gli atomi di perforazione dell’angolo di un fiocco di grafene monostrato attraverso un patch bilayer di 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) lipide in una scatola di molecole d’acqua. Le simulazioni all-atom sono di due tipi. Le simulazioni di tipo I sono state concepite per verificare l’esistenza di una forza motrice positiva per il piercing in una simulazione MD a tutti gli atomi.
Come mostrato nella Fig. 2A, una lamella triangolare di grafene inizialmente posizionata in configurazione corner-piercing attraverso il bilayer è stata osservata muoversi spontaneamente verso il basso, penetrando ulteriormente nel bilayer (Filmato S3). Nelle simulazioni di tipo II, la barriera energetica associata alla perforazione dell’angolo viene calcolata mediante simulazioni SMD(38), in cui un angolo di grafene viene tirato attraverso il bilayer da una molla virtuale (per maggiori dettagli, vedere il testo SI ). La Fig. 2B mostra l’energia di interazione grafene-bilayer calcolata dalle simulazioni SMD in funzione della distanza di penetrazione.
I calcoli SMD confermano che la barriera energetica è piccola, solo ∼5kBT, per l’angolo di grafene che attraversa la regione della testa idrofila del bilayer. Poco dopo questo punto, l’energia di interazione totale inizia a diminuire a causa delle interazioni favorevoli tra le code lipidiche nel nucleo del bilayer e un’area sempre maggiore di grafene immerso. Pertanto, sia le nostre simulazioni CGMD che quelle all-atom rivelano che la perforazione dell’angolo comporta una piccola barriera energetica paragonabile all’energia termica ed è essenzialmente un processo spontaneo.

Simulazioni di dinamica molecolare a tutti gli atomi della perforazione dell’angolo di un monostrato di grafene attraverso un bilayer lipidico. (A) Le simulazioni mostrano direttamente che la perforazione dell’angolo avviene spontaneamente. (B) Energia di interazione grafene-bilayer in funzione della distanza di penetrazione, che mostra l’esistenza di una barriera energetica di circa 5kBT associata alla perforazione dell’angolo. Il valore medio dell’energia di interazione è ottenuto da 11 simulazioni indipendenti e le barre di errore indicano la SD. Le fluttuazioni relativamente grandi dell’energia di interazione a grandi distanze di penetrazione sono dovute principalmente a movimenti traslazionali e rotazionali casuali del grafene rispetto alla membrana bilayer e a cambiamenti configurazionali casuali dei singoli lipidi adiacenti al grafene. (C) Modello analitico di perforazione dell’angolo.
Sia le simulazioni CGMD che quelle all-atom indicano che la struttura del bilayer lipidico rimane essenzialmente intatta al momento dell’inserimento del grafene, tranne che per il fatto che le code idrofobiche dei lipidi sono in qualche modo raddrizzate a causa della forte adesione alle superfici laterali del grafene. In una descrizione continua, la variazione di energia che accompagna la perforazione può essere espressa in termini di quattro variabili: hH e hT (spessori dei gruppi di testa e di coda nel monostrato lipidico, come mostrato in Fig. 2C) e γH e γT (densità dell’interazione tra una superficie laterale del grafene e la coda del gruppo. 2C) e γH e γT (densità di energia di interazione tra una superficie laterale del grafene e i gruppi di testa e di coda dei lipidi rispetto a quella tra solvente e grafene). Per un angolo di grafene con un angolo interno di 2α, il tasso di variazione dell’energia durante la perforazione può essere scritto come una funzione a quote costanti della profondità di penetrazione h come(Testo SI)
Si potrebbe essere tentati di fare un’analogia tra la perforazione degli angoli del grafene in un bilayer lipidico qui descritta e la perforazione meccanica dovuta alla concentrazione di stress negli angoli acuti. Tuttavia, sottolineiamo che il primo è un processo essenzialmente spontaneo, mentre il secondo è guidato da una forza applicata.
Esperimenti di bioimmagine.
Le figure 3 e 4 presentano micrografie elettroniche confocali a fluorescenza ed ex situ che confermano le previsioni del MD sulla penetrazione ai bordi/angoli e sull’ingresso nelle cellule di microfogli di grafene a pochi strati. Le cellule epiteliali polmonari e i cheratinociti sono rappresentativi del rivestimento epiteliale delle vie respiratorie e della pelle, rispettivamente(40), e formano monostrati piatti e unicellulari in vitro(Fig. 3). Le cellule epiteliali polarizzate hanno una rete citoscheletrica microtubulare ben organizzata, mentre i macrofagi hanno una distribuzione sottocorticale di filamenti di actina che possono essere visualizzati con la microscopia confocale a immunofluorescenza indiretta (Fig. 3 A-C, Insets). I microfogli di grafene simili a piastre sono internalizzati dalle cellule epiteliali polmonari umane(Fig. 3 A e B) e dai macrofagi(Fig. 3C) e possono essere visualizzati all’interno del citoplasma mediante imaging confocale.
È interessante notare che i piani basali del grafene mostrano un orientamento preferenziale parallelo alla superficie cellulare basolaterale attaccata al substrato. I microfogli di grafene simili a piastre interrompono fisicamente l’organizzazione citoscheletrica delle cellule epiteliali polmonari(Fig. 3 A e B) e dei macrofagi(Fig. 3C). In sezioni sottili, utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), alcuni microfogli di grafene possono essere visualizzati all’interno di vacuoli citoplasmatici all’interno dei macrofagi(Fig.3D) e delle cellule epiteliali polmonari(Fig. 3E). La struttura complessiva e l’integrità degli organelli subcellulari sono conservate come rivelato dal TEM(Fig. 3 D ed E), confermando i nostri saggi in vitro che mostrano una vitalità cellulare preservata(SI Text e Fig. S8).

Assorbimento e internalizzazione cellulare di microfogli di grafene a pochi strati. (A-C) Immagini confocali di cellule epiteliali polmonari umane(A e B) e macrofagi di topo(C) esposti a microfogli di grafene (dimensione laterale da 0,5 a 25μm) rispettivamente dopo 24 ore e 5 ore. I nuclei in A e B sono visualizzati (fluorescenza blu) con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
I microtubuli delle cellule epiteliali polmonari(A e B) sono visualizzati utilizzando anticorpi antitubulina beta coniugati con FITC (fluorescenza verde), mentre il citoscheletro di actina dei macrofagi mostrato in C è visualizzato utilizzando la rodamina-falloidina (fluorescenza rossa). Nelle cellule epiteliali polmonari non esposte(A e B, Inset), i microtubuli citoplasmatici (MT) formano una rete lineare che attraversa il citoplasma. I fiocchi di grafene internalizzati (frecce gialle, A e B) spostano fisicamente la rete microtubulare lineare.
Nei macrofagi non esposti(C, Inset), l’actina filamentosa (F) è organizzata in aggregati sotto la membrana plasmatica. I fiocchi di grafene internalizzati con grandi dimensioni laterali (freccia gialla, C) inducono aggregati densi di filamenti di actina, mentre i fogli di grafene di dimensioni submicroniche (punta di freccia gialla, C) non interrompono il citoscheletro di actina.
Le micrografie elettroniche a trasmissione di macrofagi(D) e cellule epiteliali polmonari(E) esposti a fogli di FLG a 10 ppm (∼800 nm in dimensione laterale) per 5 h e 24 h mostrano la localizzazione nel citoplasma all’interno di vacuoli legati alla membrana ( Inset blu). I microfogli di grafene all’interno dei vacuoli appaiono come sezioni lineari dense di elettroni(D, Inset) o fiocchi irregolari(E, Inset).

Interazioni della membrana cellulare con microfogli di grafene, che mostrano la penetrazione ai bordi o agli angoli per ciascuno dei tre tipi di cellule. (A) Penetrazione angolare osservata per un foglio di grafene di dimensione laterale micrometrica sulla superficie di una cellula epiteliale polmonare umana a basso e alto ingrandimento. (B) Penetrazione ai bordi di microfogli multipli (G) in un macrofago (M).(C) Penetrazione ai bordi di un foglio di 5μm che interagisce con cheratinociti umani primari, in cui l’ingresso ai bordi sembra essere stato nucleato in corrispondenza di un’asperità o di una protrusione (freccia gialla spessa). (D) Modalità di penetrazione angolare sulla superficie di un cheratinocita umano primario. L’orientamento inclinato ed eretto del foglio di grafene produce sottili ombre di e-beam immediatamente adiacenti al foglio in alcune immagini.
La topografia dei bordi altamente irregolare è visibile essenzialmente su tutti i fogli di grafene. Tutte le immagini sono micrografie elettroniche a scansione a emissione di campo di cellule fissate con postfissazione di tetrossido di osmio. I tempi di esposizione sono di 24 ore, tranne quello dei macrofagi, che è di 5 ore. Le cellule in A e B non sono state sottoposte a essiccazione al punto critico durante la preparazione del campione per la microscopia elettronica a scansione. I microfogli di grafene qui e nella Fig. 3 hanno un numero di strati che varia da 4 a 25. (Barre di scala, 2 μm).
I protocolli di imaging utilizzati nella Fig. 3 sono utili per mostrare l’internalizzazione e l’orientamento del grafene, ma non rivelano la modalità di ingresso. Abbiamo quindi effettuato esposizioni temporali più brevi per catturare il processo di assorbimento, utilizzando il SEM a emissione di campo ex situ di cellule bersaglio con la membrana esterna potenziata dalla postfissazione con tetrossido di osmio.
Le immagini sono state eseguite sia con che senza essiccazione del punto critico per verificare la presenza di artefatti da essiccazione. La Fig. 4 mostra le immagini ad alta risoluzione delle superfici cellulari esposte al grafene dopo 5 o 24 ore. La penetrazione della membrana prima ai bordi e poi agli angoli è visibile in tutti i casi e per tutti e tre i tipi di cellule bersaglio. Le Fig. 4 C e D mostrano casi particolarmente chiari di penetrazione della membrana che sembra essere iniziata da un’asperità o sporgenza sul bordo del grafene(Fig. 4C) o iniziata da un angolo del grafene(Fig. 4D).
Si noti che i bordi di questi fogli sono altamente irregolari(Fig. 4 A, C e D) e forniscono numerosi siti per la penetrazione iniziale, come descritto nella modellazione(SI Text e Fig. S9). L’internalizzazione di questi microfogli di grafene simili a lastre, con dimensioni laterali che vanno da 0,5 nm a 5 μm(Tabella S1), non ha compromesso la vitalità cellulare alle dosi e ai tempi utilizzati in questi studi in vitro.
Più in generale, tuttavia, le nanoparticelle inalate possono essere associate a effetti negativi sulla salute(41) e Schinwald et al.(7) hanno riportato che le nanopiastrine di grafene hanno indotto la formazione di un granuloma e l’infiammazione polmonare in seguito all’aspirazione faringea nei topi. L’assorbimento intracellulare e la localizzazione citoplasmatica di nanomateriali di grafene simili a piastrine possono interferire con l’organizzazione del citoscheletro(Fig. 3 A-C) e con le normali funzioni fisiologiche, tra cui la secrezione polarizzata(40), la formazione di barriere(42) e la migrazione cellulare durante il differenziamento e la riparazione di lesioni epiteliali(43).
È stato dimostrato che l’internalizzazione di nanoparticelle da parte dei macrofagi interrompe la fagocitosi e l’eliminazione di particelle e microbi dai polmoni(44, 45). Schinwald et al.(7) hanno dimostrato che le nanopiastrine di grafene non vengono eliminate prontamente dai polmoni e inducono il rilascio di mediatori proinfiammatori da parte dei macrofagi. Altri studi riportano che i nanomateriali di grafene sono biocompatibili(46, 47), e sono necessari molti altri lavori prima di poter valutare appieno i rischi per la salute dei materiali di grafene.
In sintesi, per studiare i meccanismi fondamentali delle interazioni del grafene con i bilayer lipidici sono stati utilizzati la dinamica molecolare a grana grossa, l’MD a controllo atomico, la modellazione analitica e la bioimmagine in vivo e ex situ. Le simulazioni rivelano una penetrazione diretta nel bilayer che inizia con una perforazione localizzata in corrispondenza di angoli acuti o sporgenze lungo i bordi del grafene, seguita da una propagazione lungo il bordo per raggiungere la penetrazione completa. Per un piccolo fiocco di grafene, il moto browniano e le forze motrici entropiche nella regione vicina alla membrana posizionano prima il fiocco ortogonale al piano del bilayer, il che porta poi alla perforazione spontanea dell’angolo.
Le simulazioni di dinamica molecolare a tutti gli atomi seguono l’evoluzione dell’energia libera durante la perforazione degli angoli e rivelano solo una piccola barriera energetica, paragonabile a kBT. È interessante notare che, in assenza di angoli acuti o sporgenze dei bordi, la membrana cellulare presenta un’elevata barriera energetica intrinseca contro la penetrazione di lunghi segmenti di bordo di grafene, anche se sono atomicamente sottili. Tuttavia, bordi di grafene così uniformi, atomicamente lisci, allineati orizzontalmente e di lunga lunghezza sono rari, per cui in pratica la penetrazione cellulare è spontanea grazie alla presenza di una rugosità del bordo su scala atomica o nanometrica che elimina essenzialmente la barriera energetica. Studi sperimentali di imaging confermano la penetrazione del grafene nelle membrane cellulari in una modalità dominante edge-first o corner-first per ciascuno dei tre tipi di cellule studiati: cellule epiteliali polmonari, cheratinociti e macrofagi.
Gli esperimenti mostrano anche la penetrazione e l’assorbimento di fiocchi di GFN grandi fino a 5-10 μm in dimensione laterale, il che supporta la previsione del modello secondo cui le barriere di attivazione della penetrazione non sono intrinsecamente dipendenti dalla lunghezza, a causa dell’iniziazione in corrispondenza di caratteristiche locali nitide. Una volta superata la barriera energetica iniziale per la penetrazione spontanea della membrana, ipotizziamo che l’interazione tra le superfici basali idrofobiche dei microfogli di grafene e la regione idrofobica interna della membrana plasmatica promuova l’assorbimento cellulare.
Si ritiene che le superfici idrofobiche rappresentino modelli molecolari associati al danno (DAMP) che attivano in modo non specifico la risposta immunitaria innata(48). Le superfici cellulari idrofobiche(49) e le nanoparticelle funzionalizzate in superficie(50) sono più facilmente internalizzate e innescano risposte immunitarie innate più potenti rispetto alle superfici idrofile e debolmente cariche. In base a questo meccanismo, ipotizziamo che i microfogli di grafene che penetrano nei domini lipidici idrofobici possano essere riconosciuti come DAMP dalle cellule bersaglio che costituiscono la prima linea di difesa contro le particelle e i microbi depositati sulla pelle o sul rivestimento epiteliale dei polmoni in seguito all’inalazione.

La capacità dei microfogli di grafene con grandi dimensioni laterali di penetrare ed entrare nelle cellule, qui documentata sia sperimentalmente che attraverso la simulazione, può portare alla citosalterazione dello scheletro, all’alterazione della motilità cellulare, alla compromissione della funzione di barriera epiteliale o ad altre alterazioni geometriche e steriche che meritano ulteriori studi.
Materiali e metodi
Simulazioni MD a grana grossa.
Le simulazioni a grana grossa di questo lavoro si basano sul DPD, un metodo lagrangiano derivato dalla grana grossa della dinamica molecolare(51) ampiamente utilizzato come metodo di simulazione mesoscopica per i sistemi di biomembrana(52-55). La membrana bilayer lipidica è rappresentata dal modello a grana grossa H3(T5)2(SI Text e Fig. S1)(51). Le teste lipidiche idrofile e le code lipidiche idrofobiche sono rappresentate rispettivamente da perline rosse e gialle. Una cella unitaria del grafene CG è costituita da tre perline con una distanza tra i vicini di 0,4 nm e un angolo interno di 60°.
Simulazioni MD con tutti gli atomi.
Le simulazioni MD a tutti gli atomi sono state eseguite in NAMD(58) e visualizzate in VMD(59). Il grafene e la membrana del bilayer lipidico di POPC sono stati generati rispettivamente con VMD Graphene Builder e Membrane Builder. Il grafene e il sistema bilayer lipidico sono stati poi completamente idratati (aggiungendo molecole d’acqua), utilizzando VMD. Per le simulazioni è stato adottato il campo di forza CHARMM36(60) con parametri aggiunti per il grafene e il modello dell’acqua TIP3. Le simulazioni erano composte da due fasi di equilibrio e una fase di produzione.
Poiché le membrane lipidiche generate dal plug-in di VMD erano lontane dallo stato di equilibrio, è stato eseguito un ciclo di equilibrio di 0,5 ns in cui è stato fissato tutto tranne le code lipidiche. Questa prima fase ha permesso alle code lipidiche di fondersi in una configurazione simile a quella del fluido. Nella seconda fase, i sistemi sono stati equilibrati per circa 2 ns nell’ensemble numero-pressione-temperatura (NPT) alla temperatura di 310 K e alla pressione di 1 atm. Successivamente, come terza fase, sono stati eseguiti i cicli di produzione. In tutte e tre le fasi di simulazione, i gradi di libertà fuori dal piano degli atomi di carbonio dei fiocchi di grafene sono stati limitati utilizzando vincoli armonici. Ulteriori dettagli sulle simulazioni all-atom sono riportati nel testo SI.
Esperimenti di bioimmagine.
Gli esperimenti sono stati condotti su tre tipi di cellule: macrofagi murini, cellule epiteliali polmonari e cheratinociti umani primari. Le cellule sono state esposte a campioni commerciali di microfogli di grafene a pochi strati con una gamma di dimensioni laterali (0,5-10 μm) e numero di strati(4-25). I campioni di FLG sono stati dispersi utilizzando 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) (Avanti Polar lipids)/albumina prima di essere aggiunti al terreno di coltura cellulare(Fig. S10). Cento microlitri di fiocchi di grafene in una soluzione madre di etanolo da 5 mg/mL sono stati aggiunti a 62 μL di una soluzione di DPPC/etanolo da 40 mg/mL e agitati per 5 s, seguiti dall’aggiunta di 838 μL di PBS contenente il 2% (vol/vol) di albumina per produrre una soluzione madre di grafene da 500 μg/mL (ppm) contenente 2,5 mg di DPPC e il 2% di albumina/PBS.

La quantità di proteine adsorbite che risulta dall’applicazione di questo protocollo è stata misurata in esperimenti di controllo separati ed è risultata pari al 3-46% dell’area superficiale del GFN, a seconda delle condizioni e del campione(SI Text). Per i cheratinociti, la soluzione madre di grafene è stata diluita a 10 μg/mL di grafene in un terreno basale per cellule dermiche contenente integratori per la crescita dei cheratinociti, mentre RPMI 1640 è servito come terreno di diluizione per macrofagi e cellule epiteliali polmonari. Ulteriori dettagli sulla coltivazione dei tre tipi di cellule sono riportati nel testo SI.
Microscopia confocale a fluorescenza.
Le cellule epiteliali polmonari sono state esposte a scaglie di grafene per 24 ore. Le cellule sono state lavate e colorate con l’anticorpo antitubulina coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) (Cell Signaling; 3623S) e 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). I macrofagi sono stati esposti al grafene per 5 ore come descritto sopra. Le cellule sono state lavate e colorate con falloidina coniugata con rodamina e DAPI. Le immagini sono state visualizzate con un microscopio confocale a fluorescenza invertito motorizzato Olympus (modello IX81) per valutare l’assorbimento e l’organizzazione citoscheletrica.
Microscopia elettronica.
Per la preparazione dei campioni TEM sono stati utilizzati due metodi diversi per verificare che i fiocchi di grafene vengano assorbiti dalle cellule. Le cellule sono state fissate con il fissativo di Karnovsky [5% (vol/vol) glutaraldeide, 4% (vol/vol) formaldeide in tampone sodio cacodilato 0,1 M, pH 7,4]. (Electron Microscopy Sciences; 11650) a 4 °C, quindi risciacquati tre volte con tampone sodio cacodilato 0,1 M e postfissati in tetrossido di osmio acquoso al 2% (vol/vol) (Electron Microscopy Sciences; RT 19152). I campioni sono stati disidratati in soluzioni di etanolo graduato freddo e poi in acetone anidro freddo.
L’infiltrazione dei campioni è stata ottenuta utilizzando la resina Durcupan ACM (Electron Microscopy Sciences) con proporzioni decrescenti di acetone e infine con il solo Durcupan. Le cellule sono state incorporate nel Durcupan e polimerizzate a 60 °C per 48 ore. I blocchi cellulari sono stati sezionati a 80 nm su un ultramicrotomo Reichert Ultracut con un coltello diamantato (cellule non trattate) o un coltello di vetro. Le sezioni sono state posizionate su griglie di rame e visualizzate su un microscopio elettronico a trasmissione Philips 410 dotato di una telecamera CCD Advantage HR. Le immagini sono state acquisite con il software di imaging Advanced Microscopy Techniques. La localizzazione intracellulare dei nanosheet di grafene è stata confermata anche sezionando cellule cresciute in monostrato su vetrini coprioggetto.
Per la microscopia elettronica a scansione, le cellule sono state postfissate in tetrossido di osmio acquoso al 2% (vol/vol) per 30 minuti, seguito da disidratazione in etanolo al 25% (vol/vol), 50% (vol/vol), 70% (vol/vol), 2 × 95% (vol/vol) e 3 × 100% (vol/vol). Dopo l’essiccazione al punto critico secondo le indicazioni del produttore (Ladd Research), i coprioggetti sono stati rivestiti di oro per sputtering e osservati con il SEM a emissione di campo (LEO 1530-VP). Maggiori dettagli sul metodo sono riportati nel testo SI.
Paula Weston, Ashish Jachack, Paulette Ferland e il Dr. Charles Vaslet. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (Grants CMMI-1028530 e CBET-1132446) e dal Programma di ricerca Superfund dell’Istituto nazionale di scienze della salute ambientale (Grant P42 ES013660).
Fonti: pnas.org & legitim.ch
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